頭條創(chuàng )作挑戰賽

如果說(shuō)近幾年生物學(xué)技術(shù)最出風(fēng)頭的是哪個(gè)，非CRISPR基因編輯無(wú)疑了。

起初是在學(xué)界比較火熱，在基因編輯嬰兒出生后就變成了社會(huì )熱點(diǎn)了。

涉事科學(xué)家賀建奎以非法行醫罪入獄，最近出獄后于大興落戶(hù)開(kāi)展基因合成方面的研究工作。

22年9月份發(fā)布的招聘啟事

對于此人和事，我并不打算討論，因為了解的信息比較少，思考的也比較淺薄。

這事發(fā)生在18年，作為一個(gè)植物學(xué)方面的學(xué)生，當時(shí)是在考慮將CRISPR技術(shù)應用到楊樹(shù)和擬南芥的基因改造的，突然聽(tīng)說(shuō)此事只是覺(jué)得情理之中，更有種來(lái)的太早的感覺(jué)。

不過(guò)后來(lái)僅僅是粗淺的了解了一下該技術(shù)，我本人并沒(méi)有進(jìn)行這個(gè)技術(shù)的實(shí)踐，僅僅參與了原理學(xué)習和實(shí)驗設計部分。

擬南芥的野生型和突變型的生長(cháng)情況對比

前幾日看到賀建奎發(fā)布的關(guān)于CRISPR技術(shù)在醫學(xué)方面的應用，覺(jué)得應該繼續學(xué)習一下這個(gè)技術(shù)，以跟進(jìn)生物科學(xué)的進(jìn)步。

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一. CRISPR的發(fā)現史

1987年，Nakata研究組在分析大腸桿菌（Escherichia coli）中基因iap及臨近序列（flanking regions）時(shí)，偶然地發(fā)現在位于iap的3’端存在含有29個(gè)堿基的高度同源序列重復性出現，且這些重復序列被含32個(gè)堿基的序列間隔開(kāi)，當時(shí)科學(xué)家并不清楚這種序列的生物學(xué)意義。隨后的幾年（1989年-1999年），陸續有相關(guān)研究指出類(lèi)似的重復序列存在于多種細菌及古生菌中。2000年，Mojica和同事通過(guò)比對發(fā)現這種重復元件存在于20多種細菌及古生菌中，并將這種核酸序列命名為短規律性間隔重復序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，因其高度保守性，猜測其一定具有重要的生物學(xué)功能。

大腸桿菌圖

CRISPR一詞正式登上歷史舞臺還是2002年的事。Jansen實(shí)驗室通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現這種新型DNA序列家族只存在于細菌及古生菌中，而在真核生物及病毒中沒(méi)有被發(fā)現，并將這種序列稱(chēng)為規律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)。他們將臨近CRISPR locus的基因命名為cas（CRISPR-associated），并發(fā)現了4個(gè)cas基因（cas1, cas2, cas3, cas4）。

2005年，Mojica，Bolotin和Pourcel三個(gè)研究組指出CRISPR中的間隔序列來(lái)自于外來(lái)噬菌體或質(zhì)粒，其中Mojica實(shí)驗室驚喜地發(fā)現病毒無(wú)法感染攜帶有與病毒同源間隔序列的細胞，而易侵入那些沒(méi)有間隔序列的細胞，由此他們提出CRISPR可能參與細菌的免疫功能的假說(shuō)。

CRISPR結構

（from 作者：制御秘書(shū)長(cháng)杜鵑 https://www.bilibili.com/read/cv15465570/ j 出處：bilibili）

（到這里CRISPR被發(fā)現已是必然，從同源序列重復性出現被發(fā)現，到發(fā)現病毒無(wú)法感染攜帶有與病毒同源間隔序列的細胞，而易侵入那些沒(méi)有間隔序列的細胞。

到這里CRISPR系統的功能已經(jīng)被暗示的相對明顯，剩下的是驗證了）

CRISPR能在細菌的免疫功能中起作用在2007首次得到實(shí)驗證實(shí)。Horvath研究組發(fā)現嗜熱鏈球菌被病毒入侵后整合了來(lái)自噬菌體基因組新的間隔區序列，同樣的病毒再次入侵時(shí)細菌就有了抗性，使其免遭攻擊。同時(shí)人為地去除或添加特定的間隔區序列，會(huì )影響細菌的抗性表型。因此，他們認為CRISPR及cas基因一起為嗜熱鏈球菌提供了對噬菌體的抗性作用，同時(shí)抗性的特異性取決于CRISPR中的間隔區序列，細菌的這種免疫性是可以遺傳的。至此，雖然科學(xué)家并不清楚CRISPR/Cas抵抗病毒的具體機制，但他們開(kāi)始逐漸揭開(kāi)其神秘的面紗。

2008年，Oost實(shí)驗室揭示了宿主細胞中CRISPR的間隔序列如何在cas蛋白的協(xié)助下介導發(fā)揮抗病毒作用。他們發(fā)現在CRISPR轉錄后，cas蛋白會(huì )形成一個(gè)稱(chēng)為Cascade的復合物，裂解每個(gè)重復單元中的CRISPR RNA前體（pre-crRNA），但裂解產(chǎn)物都保留了間隔序列。在解旋酶cas3的作用下，成熟的CRISPR RNA(crRNA)發(fā)揮小向導RNA（small guide RNA）的角色，促使Cascade干預病毒的增殖。2009年，Mojica團隊指出前間隔序列臨近的PAM序列為原核生物中CRISPR/Cas發(fā)揮免疫識別提供了靶標。

2011年，Charpentier研究組通過(guò)對人類(lèi)病原體化膿性鏈球菌的差異化RNA測序，揭示了反式編碼crRNA（tracrRNA）參與pre-crRNA的加工成熟過(guò)程。他們指出，tracrRNA通過(guò)24個(gè)核苷酸與pre-c中的重復序列互補配對，在保守的內源性RNA酶III和CRISPR相關(guān)的Csn1蛋白的參與下指導pre-cr RNA的成熟過(guò)程，這些組分對保護化膿性鏈球菌免受噬菌體DNA的入侵必不可少，研究揭示了crRNA成熟的新途徑。

以上介紹CRISPR/Cas的發(fā)現及細菌、古細菌如何利用該系統來(lái)沉默外來(lái)核酸以抵御病毒及質(zhì)粒的入侵。

CRISPR/Cas作為基因編輯系統被應用最早開(kāi)始于2012年兩位女神的強強聯(lián)合，她們分別是來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的結構生物學(xué)家詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）和瑞典于默奧大學(xué)的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）。她們通過(guò)體外實(shí)驗證明：成熟的crRNA通過(guò)堿基互補配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結構，指導cas9蛋白在目標DNA上引起雙鏈斷裂。在與crRNA指導序列互補的位點(diǎn)，cas9蛋白的HNH核酸酶結構域切割crRNA的互補鏈，而cas9蛋白RuvC結構域切割非互補鏈。當雙tracrRNA：crRNA被嵌合到一條RNA時(shí)，同樣可以指導cas9切割雙鏈DNA。她們的研究證明，在雙鏈RNA指導下切割雙鏈DNA斷裂的內切酶家族并揭示了CRISPR/Cas系統在RNA指導下進(jìn)行基因編輯的巨大潛力。

之后就是各位大神在各種疾病、各種物種的CRISPR基因編輯實(shí)踐，到目前發(fā)現、開(kāi)發(fā)出各種應用方法。

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CRISPR 系統的工作細節

CRISPR/Cas9 系統的工作細節

不同類(lèi)型的有一定的差異

對CRISPR系統的深入利用的基礎是建立在自然界中本就存在的CRISPR 防御機制的認識發(fā)現上的。

二型CRISPR系統的結構，由CAS基因和CRISPR序列區組成

有幾種不同類(lèi)型的CRISPR系統，廣泛較先被了解的是2型CAS9

CRISPR介導的細菌免疫機制（from金斯瑞）

CRISPR/Cas適應性免疫系統分為兩個(gè)主要階段：免疫獲得和免疫效應。

在免疫獲得階段，Cas蛋白剪切外源性病毒DNA，然后將該外源性DNA作為間隔序列（Spacer）插入細菌基因組重復間隔區序列之間,插入位置為首個(gè)重復序列前。

在免疫效應階段，當細菌再次感染病毒后，重復間隔區序列轉錄形成前體crRNA（Pre-crRNA）。隨后Cas核酸內切酶在反式激活crRNA（tracrRNA）指導下與前體crRNA結合，經(jīng)RNAse III剪切后形成成熟的 crRNA-Cas-tracrRNA復合物 。成熟的crRNA作為gRNA（GuideRNA,gRNA）與病毒DNA配對，觸發(fā)Cas剪切活性進(jìn)而干擾病毒DNA正常復制的。

CRISPR array 包含repeat序列和spacer序列, 這兩種不同的序列是間隔開(kāi)來(lái)的, 本著(zhù)兩個(gè)repeat序列夾一個(gè)spacer序列, 如上圖所示, 黑色菱形代表repeat序列, 不同顏色的方形則代表了不同的spacer序列.

Repeat序列在同一細菌中的堿基組成和長(cháng)度是相對保守的, 基本不變. 在不同的細菌之間會(huì )有些許差異. Spacer序列則是用來(lái)錨定目的外源基因的, 所以spacer的序列堿基組成差異較大, 因為他們來(lái)自于不同的外源基因. Spacer 基因當中包含著(zhù)被錨定基因組中的特異性高的保守序列, 確保在之后轉錄出的RNA 可以與被錨定基因組精確配對. CRISPR array之前通常會(huì )有一個(gè)富含A-T的leader sequence, 這個(gè)序列中包含啟動(dòng)子, 是用來(lái)啟動(dòng)repeat 和spacer序列轉錄的. CRISPR array 不包含閱讀框(ORF, open reading frame).

規律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)，以上的repeat序列和spacer序列的重復排列以及repeat序列區含有回文序列（可以形成發(fā)卡結構）的情況和 規律間隔——成簇——短回文重復序列進(jìn)行對應。

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困擾我的問(wèn)題和CRISPR/Cas 系統的類(lèi)別

困擾我良久的疑問(wèn)：重復序列的回文能形成頸環(huán)結構的特征有什么生物學(xué)意義，是不是在pre-crRNA向crRNA的成熟過(guò)程發(fā)揮作用。

但是不少資料，如上一節的第一張圖顯示，crRNA的成熟過(guò)程是由Trans-RNA的互補介導的。下圖展示的是另一種，pre-crRNA的repeats內部形成頸環(huán)結構，后被cas6或其他核糖核酸酶剪切形成crRNA.個(gè)人認為后者更為合理，但不排除兩種機制都是存在的。

fromAnalysis of CRISPR Pre-crRNA Cleavage

懷著(zhù)這樣的疑惑在pubmed上翻了一段時(shí)間后，才知道這兩種情況分別存在于不同類(lèi)型的CRISPR/Cas 系統中。

fromThe crRNA Maturation Pathways of Class 1 and Class 2 CRISPR-Cas Systems

在1類(lèi)系統中，CRISPR陣列被轉錄產(chǎn)生長(cháng)長(cháng)的pre-crRNA。Cas6家族酶識別重復結構或序列，并將RNA加工成中間或成熟的crRNA。在某些情況下（例如，I-A型和I-B型），Cas6充當二聚體來(lái)處理非結構化的前crRNA。

2類(lèi)系統中的crRNA成熟度差異很大。在II型中，tracrRNA（紅色）和pre-crRNA形成雙鏈體，它們被Cas9結合和穩定。這使得宿主蛋白RNase III能夠進(jìn)行處理。中間crRNA通過(guò)未知的RNA酶進(jìn)一步成熟。II-C型系統被描述為采用RNase-III非依賴(lài)性途徑。

在這里，重復序列內的啟動(dòng)子序列能夠進(jìn)行內部轉錄和成熟crRNA的形成，形成結合Cas9的crRNA：tracrRNA雙鏈體。在V-A型和VI型中，Cas12a和Cas13分別識別其重復序列的結構和序列，以便切割莖結構上游的pre-crRNA。在 V-A 型中，會(huì )發(fā)生額外的未表征處理事件。通過(guò)VI型Cas13處理產(chǎn)生成熟的crRNA。

條條大路通羅馬，生物演化過(guò)程中并不會(huì )設計好一切，在演化力量和環(huán)境壓力的共同作用下，總會(huì )走出不同的合適的路徑生存下來(lái)。crRNA不同的成熟路徑就是最好的例證，生命科學(xué)的美妙之處就在此。

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CRISPR的基因編輯方法

靶向目標序列：基因編輯的第一步也是最重要的一步就是在基因組上找到需要進(jìn)行編輯的位置?；蚪M數據龐大復雜，例如人類(lèi)的基因組DNA大小達到3GB。在龐大的基因組中定位到需要剪切的部位需要一個(gè)高效、精準的定位方法。

形成DNA斷裂：定位到目標基因組位置以后，借助核酸內切酶在DNA雙鏈上形成雙 鏈DNA斷裂，以此激發(fā)細胞本身的DNA修復機制。

修復斷裂同時(shí)引入敲除或敲入：DNA雙鏈斷裂后，會(huì )激發(fā)細胞本身的DNA修復機 制。細胞的DNA損傷修復包含兩種主要途徑，一種是非同源性末端結合 （Non-homologous End Joining, NHEJ），即易錯修復。NHEJ途徑會(huì )在修復位點(diǎn)引 起隨機插入或缺失，造成移碼突變，使得基因不再表達，由此形成基因敲除。另一種是同源重組介導的修復（Homology directed repair, HDR），即精準修復。HDR途徑能借助外源引入的單鏈或雙鏈DNA為模板介導基因替換或插入，這種方式可以將一段DNA序列精準地插入特定的基因組位點(diǎn)，由此完成基因敲入或替換。

從實(shí)驗角度來(lái)看，NHEJ的發(fā)生是因為未提供DonorDNA作為供體來(lái)進(jìn)行HDR過(guò)程。

DNA斷裂的修復是生物自救的本能，非同源末端連接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)和同源重組(Homologousrecombination)兩種修復DNA斷裂的方式廣泛存在于大多數生物體內，Donor DNA的提供是提高了同源重組可能。

在Donor DNA中引入突變信息是一種對DNA斷裂的修復的巧妙應用，再結合CRISPR打斷技術(shù)就是絕佳的精準突變目標DNA位點(diǎn)的手段了。

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方便的sgRNA

single guide RNA

天然的rRNA和tracrRNA復合物介導的Cas9剪切

人工設計的sgRNA介導的Cas9剪切

sgRNA設計基于自然界中天然存在的crRNA和tracrRNA。核苷酸1-32是天然存在的crRNA。核苷酸37-100是天然存在的tracrRNA。Briner等人在兩個(gè)片段之間添加了-GAAA-接頭，使它們成為一個(gè)單一的RNA片段。

sgRNA序列和二級結構

簡(jiǎn)化了CRISPR系統，這樣就不必在實(shí)驗中表達三種東西（即Cas9，tracrRNA和crRNA）。相反，只需要表達Cas9和sgRNA。部件越少，越可靠，系統效率越高。

sgRNA序列和二級結構以及設計思路

sgRNA二級結構，灰色矩形區域代表全長(cháng)sgRNA支架中的額外的重復序列與其重復反義序列，在基因工程設計sgRNA時(shí)候通常是被去掉的。黃色區域代表sgRNA的3尾巴，這對于Cas9功能不是必要的，在sgRNA-bound結構中是被省略掉的。

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CRISPR的失誤off-target

失誤在所難免，生命科學(xué)也在其中。

CRISPR切割目標DNA是依賴(lài)于sgRNA對靶序列的互補結合作用的。在當下優(yōu)化后的工程化 CRISPR系統包含兩個(gè)組件：一是Cas酶，特異性的切割其PAM位點(diǎn)上有的3和4堿基之間的，造成DNA鏈斷裂。一是sgRNA，其一方面提供互補作用結合到目標靶序列，一方面提供特殊的一段序列和Cas酶結合，將Cas酶拉到目標序列旁邊，使得Cas酶識別旁邊的PAM位點(diǎn)后進(jìn)行DNA切割。

實(shí)際生物基因組序列復雜度非常高，高度相似的序列往往存在，而在非完全匹配的情況下，CRISPR系統也是可以工作的。

因此在實(shí)際應用中脫靶效應是必須要考慮進(jìn)去和考察的。

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CRISPR的技術(shù)擴展

張峰實(shí)驗室對CRISPR系統做了一步小小的改造，才讓Cas9系統有了其后的大放光彩。

這個(gè)問(wèn)題說(shuō)穿了會(huì )讓人頓覺(jué)恍然大悟甚至覺(jué)得不值一提，Cas9系統無(wú)法使用在高等動(dòng)物中的原因，僅僅是因為哺乳動(dòng)物細胞具有細胞核和核膜，RNP（crRNA-cas9復合體）無(wú)法進(jìn)入細胞核對DNA進(jìn)行切割。張峰的做法是給cas9蛋白添加了SV40 NLS（Nuclear localization sequence），幫助Cas9進(jìn)入細胞核。這樣一來(lái)，哺乳動(dòng)物細胞基因編輯的最后一個(gè)障礙也被克服了。

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CRISPR-PAM-Cas

CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas9蛋白和一個(gè)短DNA序列，這個(gè)短的DNA序列通常在靶DNA的3‘‘末端作用，被稱(chēng)為protospacer adjacent motif（PAM）。

PAM（CRISPR序列臨近的3個(gè)核苷酸NGG為PAM）作為CRISPR序列在基因組上的一個(gè)標記，對于靶向識別至關(guān)重要，靶向識別的結果是Cas9的兩個(gè)核酸內切酶結構域(兩把分子剪刀)將PAM前的3-4核苷酸間的3-5’磷酸二酯鍵切斷，造成DSB（雙鏈斷裂）。

CRISPR介導的細菌免疫機制（from金斯瑞）

CRISPR/Cas適應性免疫系統分為兩個(gè)主要階段：免疫獲得和免疫效應。

在免疫獲得階段，Cas蛋白剪切外源性病毒DNA，然后將該外源性DNA作為間隔序列（Spacer）插入細菌基因組重復間隔區序列之間,插入位置為首個(gè)重復序列前。

在這個(gè)階段Cas9是通過(guò)識別病毒DNA中的PAM（NGG）位點(diǎn)后進(jìn)行切割，才有后續一系列反應的。

在免疫效應階段，當細菌再次感染病毒后，重復間隔區序列轉錄形成前體crRNA（Pre-crRNA）。隨后Cas核酸內切酶在反式激活crRNA（tracrRNA）指導下與前體crRNA結合，經(jīng)RNAse III剪切后形成成熟的 crRNA-Cas-tracrRNA復合物 。成熟的crRNA作為gRNA（GuideRNA,gRNA）與病毒DNA配對，觸發(fā)Cas剪切活性進(jìn)而干擾病毒DNA正常復制的。

在這個(gè)階段，Cas9在其結合gRNA的指引下結合到PAM前的序列，然后識別PAM后進(jìn)行切割工作。換句話(huà)說(shuō)，就是說(shuō)gRNA將PAM放到Cas9面前。

from金斯瑞

Cas蛋白的PAM特異性是可改造的。

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CRISPR拓展應用

from金斯瑞

利用CRISPR/Cas能特異性的結合特定序列的性質(zhì)，進(jìn)行改造應用。

逆練武功的CRISPR介導的CHIP技術(shù)

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是研究DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。

傳統的ChIP是靶定特定蛋白質(zhì)，在活細胞狀態(tài)下固定蛋 白-DNA復合物，將其隨機切斷為片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法特異性地富集目的蛋白結合 的DNA片段，通過(guò)對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

CRISPR/Cas9介導的ChIP是反向的，即靶定基因組區域然后鑒定哪種蛋白質(zhì)在那里。通過(guò)將細胞核定位信號和表位標簽引入催化失活的Cas9 （dCas9），可形成通過(guò)gRNA 靶向的DNA結合蛋白。

現有g(shù)RNA數據庫和設計工具能夠靶向任何目的基因。而 dCas9與染色質(zhì)形成的復合物可以用傳統的染色質(zhì)免疫沉淀 （ChIP） 技術(shù)進(jìn)行純化，并 通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)一步鑒定。

CRISPR介導的CHIP技術(shù)已被用于識別與干擾素調節因子1 （IRF-1） 的啟動(dòng)子區 域相關(guān)的蛋白，其受到干擾素γ刺激會(huì )產(chǎn)生反應。在該研究中，研究人員純化了15種相關(guān)蛋白，包括組蛋白脫乙?；笍秃衔镆约稗D錄因子、組蛋白和其他DNA相關(guān)蛋白。相比傳統的CHIP方法，CRISPR介導的CHIP具有眾多優(yōu)勢。

傳統的ChIP的大規模分析需要使用靶向每種DNA結合蛋白的多個(gè)抗體或者生成并表達表位標記蛋白，但 CRISPR/Cas9系統的模塊化特性只需靶向Cas9蛋白的單個(gè)抗體進(jìn)行純化。此外， CRISPR/Cas9系統不受基因表達水平低、差異基因表達或毒性基因表達等問(wèn)題的影響。

巧妙改造的CRISPRi/CRISPRa

利用dCas9無(wú)核酸內切酶活性但仍能與DNA結合的特點(diǎn)設計的CRISPR/dCas9系 統，可按照預先設計的gRNA靶向特定基因的轉錄起始位點(diǎn)上游，同時(shí)結合轉錄激活或抑 制相關(guān)因子啟動(dòng)或終止靶向基因的轉錄來(lái)調控靶基因的表達。

博德研究所的張鋒實(shí)驗室率先將CRISPR/Cas9協(xié)同轉錄激活調節子 （SAM） 系統 應用于基因激活試驗。SAM系統能夠強效激活內源性基因的轉錄，其通過(guò)gRNA靶向結 合到轉錄起始位點(diǎn)上游200 bp內的位置。利用SAM系統激活基因表達方面的研究表 明，通過(guò)轉錄激活，可使部分基因的轉錄提高到原來(lái)的3000倍。同時(shí)SAM系統具有 多重基因激活能力，可同時(shí)激活10個(gè)基因的轉錄。此外研究還證明SAM可激活非編碼元 件，如基因間區長(cháng)鏈非編碼RNA。使用靶向全基因組的SAM gRNA文庫進(jìn)行功能獲得性篩選，可快速鑒定出疾病模型 或發(fā)育/分化過(guò)程中控制目的表型出現的關(guān)鍵基因42。博德研究所設計的靶向人全基因組 SAM文庫針對每個(gè)基因設計3種不同的gRNA，每個(gè)gRNA靶向23430個(gè)編碼亞型中的一 個(gè)，這些亞型包含人類(lèi)基因組中獨特的轉錄起始位點(diǎn)，該SAM文庫總共包含70290條 gRNA。

其余的CRISPR活體成像也是基于對Cas蛋白的目的性改造完成的。

可以說(shuō)CRISPR系統的發(fā)現和應用極大地促進(jìn)了DNA/RNA和蛋白互作的操作水平。

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CRISPR/Cas系統的醫療應用

遺傳性疾病的糾正

CRISPR/Cas9最令人興奮的應用之一是它可用于治療由單基因突變引起的遺傳性疾病。此類(lèi)疾病的例子包括囊性纖維化 （CF）、杜氏肌營(yíng)養不良癥 （DMD） 和血紅蛋白病。到目前為止，這種方法目前僅在臨床前模型中得到驗證，但有希望很快將其轉化為臨床實(shí)踐。

Schwank等人使用CRISPR / Cas9來(lái)研究CF的治療。使用從兩名CF患者獲得的成人腸道干細胞，他們成功地糾正了腸道類(lèi)器官中引起CF的最常見(jiàn)突變。他們證明，一旦突變被糾正，CF跨膜導體受體（CFTR）的功能就會(huì )恢復。另一種已經(jīng)研究CRISPR / Cas9的疾病是DMD。Tabebordbar等人最近使用腺相關(guān)病毒（AAV）遞送CRISPR / Cas9核酸內切酶，通過(guò)刪除含有原始突變的外顯子來(lái)恢復DMD小鼠模型中的肌營(yíng)養不良蛋白表達。這會(huì )產(chǎn)生截短但仍然起作用的蛋白質(zhì)。治療的小鼠被證明可以部分恢復肌肉功能缺陷。值得注意的是，在補充成熟肌肉組織的肌肉干細胞中編輯了肌營(yíng)養不良蛋白基因。這對于確保CRISPR / Cas9的任何治療效果不會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的推移而消退非常重要。

兩項類(lèi)似的研究描述了在體內使用CRISPR / Cas9系統來(lái)增加肌營(yíng)養不良蛋白基因的表達并改善DMD小鼠模型中的肌肉功能。其他研究使用CRISPR / Cas9在體外靶向人類(lèi)肌營(yíng)養不良蛋白基因中外顯子的重復，并表明這種方法可以導致DMD個(gè)體的肌管中產(chǎn)生全長(cháng)肌營(yíng)養不良蛋白。

CRISPR / Cas9也可用于治療血紅蛋白病。Canver等人最近發(fā)現，CRISPR/Cas9破壞BCL11A增強子可以在小鼠和原代人紅細胞中誘導胎兒血紅蛋白。將來(lái)，這種方法可以使胎兒血紅蛋白在成人血紅蛋白異常的患者中表達。對于患有鐮狀細胞病或地中海貧血等疾病的患者，這將代表一種新的治療策略。

艾滋病毒的治療

CRISPR/Cas9的另一個(gè)潛在臨床應用是治療傳染病，如HIV。雖然抗逆轉錄病毒療法為艾滋病毒提供了有效的治療方法，但由于病毒永久整合到宿主基因組中，目前尚無(wú)治愈方法。

Hu等人表明，CRISPR / Cas9系統可用于靶向HIV-1基因組活性。這種滅活的HIV基因在各種細胞中的表達和復制，這些細胞可以潛伏感染HIV，而沒(méi)有任何毒性作用。此外，細胞也可以針對HIV-1感染進(jìn)行免疫。這是克服當前如何消除感染者艾滋病毒問(wèn)題的潛在治療進(jìn)展。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的改進(jìn)，作者認為他們的發(fā)現可能使基因療法或基因改變的骨髓干細胞或誘導多能干細胞的移植能夠根除HIV感染。賀先生就是因為相關(guān)應用進(jìn)去的。

體外工程體細胞治療惡性腫瘤或其他疾病

人們對使用CRISPR / Cas9修飾患者來(lái)源的T細胞和干細胞/祖細胞的可能性越來(lái)越感興趣，然后可以將其重新引入患者體內以治療疾病。這種方法可以克服與如何有效地將基因編輯傳遞給正確細胞相關(guān)的一些問(wèn)題。

T細胞基因組工程已經(jīng)在治療血液系統惡性腫瘤方面取得了成功，并有可能治療實(shí)體癌，原發(fā)性免疫缺陷和自身免疫性疾病。T細胞的遺傳操作以前效率低下。然而，舒曼等人最近報道了一種基于CRISPR/Cas9系統的人類(lèi)CD4 T細胞更有效的方法。他們的技術(shù)允許對原代人類(lèi)T細胞中的基因組進(jìn)行實(shí)驗和治療性敲除和敲入編輯。他們證明T細胞可以以防止PD-1蛋白的表達，其他研究表明，這可能允許T細胞靶向實(shí)體癌。

人們也有興趣在多能干細胞或原代體細胞中使用CRISPR / Cas9介導的基因組編輯來(lái)治療疾病。例如Xie等人12表明，引起β地中海貧血的突變可以在人誘導的體外多能干細胞中得到糾正。他們認為，在未來(lái)，這種方法可以為骨髓移植提供細胞來(lái)源，以治療地中海貧血和其他類(lèi)似的單基因疾病β。

局限性

在將CRISPR/Cas9的潛力轉化為臨床的有效治療之前，仍然存在許多挑戰。一個(gè)特殊的問(wèn)題是如何將基因編輯傳遞給正確的細胞，特別是如果要在體內進(jìn)行治療。為了在體內安全地遞送編碼Cas9核酸酶基因并引導RNA而沒(méi)有任何相關(guān)毒性，需要合適的載體。AAV以前一直是基因傳遞的首選選擇。然而，這種遞送系統可能太小，無(wú)法有效轉導Cas9基因?？梢允褂幂^小的Cas9基因，但這對療效有額外的影響。 許多其他非病毒遞送系統正在研究中，這一過(guò)程需要進(jìn)一步優(yōu)化。

另一個(gè)重要的問(wèn)題是，脫靶效應?；蚪M的錯誤編輯可能會(huì )給患者帶來(lái)嚴重的長(cháng)期并發(fā)癥，包括惡性腫瘤。在限制脫靶活性時(shí)，Cas9核酸酶的濃度和Cas9表達的時(shí)間長(cháng)度都很重要。盡管最近對核酸酶的修飾提高了特異性，但需要進(jìn)一步的工作來(lái)最大限度地減少脫靶效應并確定任何治療的長(cháng)期安全性。

本文中考慮的CRISPR / Cas9的治療應用主要針對體細胞。圍繞CRISPR / Cas9的一個(gè)特別有爭議的問(wèn)題是胚胎中的基因編輯。已經(jīng)表明，CRISPR / Cas9技術(shù)可以改變人類(lèi)胚胎3的基因組，理論上可以證明可用于遺傳疾病的植入前治療。然而，種系的任何基因改造都是永久性的，長(cháng)期后果尚不清楚。許多人在任何情況下都反對種系修飾，理由是最終后果可能是非治療性遺傳增強。

from金斯瑞

此外，可以使用CRISPR/Cas9的倫理界限仍有待完全確定，該技術(shù)有可能徹底改變許多兒科疾病的治療，在臨床實(shí)現這種潛力之前，必須克服許多實(shí)際和道德挑戰。

和許多新興科技一樣，基因編輯也是一把雙刃劍。慎重使用是負責的態(tài)度，不必恐慌，不必苛責。潛在的受益人是所有人的技術(shù)是值得的。