基本方案1：堿裂解法制備粗制裂解物
01實(shí)驗材料
含有氨芐青霉素或其他適當的選擇性試劑的LB培養基或豐富培養基（如超級肉湯或TB超級肉湯培養基)帶有質(zhì)粒的大腸桿菌菌株葡萄糖/Tris/EDTA (GTE)溶液卵清溶菌酶NaOH/SDS 溶液3 mol/L乙酸鉀溶液，pH 約5.5異丙醇70%乙醇約20 ml容量的高速離心管
02實(shí)驗步驟
1)往5 ml的含選擇性試劑（通常是氨芐青霉素）的LB培養基或豐富培養基接種單菌落，于37℃劇烈振蕩培養過(guò)夜。
2)往2L燒瓶中加入 500 ml含有適當抗生素的LB培養基，然后加人1 ml過(guò)夜培養的大腸桿菌培養物，再于37℃培養至飽和狀態(tài)（OD600≈4)，于4℃，6000g離心10 min。
注意：為提高產(chǎn)量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度﹔振搖速度應大于400r/min。
3）用4 ml GTE溶液重懸沉淀，并轉移到一個(gè)容積≥20 ml的高速離心管中。
4)加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液（終濃度5 mg/ml)，徹底重懸沉淀，于室溫放置10 min。
注意：如果 DNA要用層析法純化，加入50 ug/ml RNA酶A以降解RNA。
5）加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。
6)加入7.5 ml 3 mol/L乙酸鉀溶液，用吸管輕輕攪拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10 min。
7)于4℃，20 000g離心10 min，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見(jiàn)的漂浮物可用數層紗布過(guò)濾。
8)加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5~10 min。
9)室溫，15 000g離心10 min。棄上清，加入2 ml 70%乙醇輕輕洗滌沉淀。
10)室溫，15 000g短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥。4℃無(wú)限期保存。
基本方案2：氯化銫/溴化乙錠平衡離心法
01實(shí)驗材料
來(lái)自于粗裂解物制備的沉淀或上清TE緩沖液pH 7.5氯化銫(CsCl)10 mg/ml溴化乙錠溶液Dowex AG5OW-X8陽(yáng)離子交換樹(shù)脂l g/ml CsCI/TE溶液0. 2 mol/L NaCI/TE緩沖液100%乙醇和70%乙醇5 ml 快封超離心管
02實(shí)驗步驟
1）粗裂解物制備方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE緩沖液中，加人4.4 g CsCl,溶解后，再加入0.4 ml 10 mg/ml溴化乙錠。
注意:溴化乙錠是一種誘變劑并能造成環(huán)境污染，操作時(shí)應戴手套，并且妥善處理。
2)將溶液轉入一個(gè)5 ml 的 quick-seal 快速封口的超離心管中，往管中加人1 g/ml CsCl/TE溶液，封好離心管。
3)于20℃，500 000g離心3.5 h或于20℃，以350 000 g 離心14 h 以上。
注意:必須在溫度不低于15℃下離心，這是為了防止對轉子和離心機的損壞以及潛在的嚴重的人員傷害。
4)小心地取出管子，從管的頂端插人一支20-G針頭，然后用帶另一20-G針頭的3 ml注射器將質(zhì)粒帶吸出（針頭插入質(zhì)粒帶下約1 cm)。
注意:為了防止紫外線(xiàn)對眼睛的嚴重損傷，應戴紫外防護眼鏡或面罩。操作溴化乙錠時(shí)要戴手套。
5）為了得到更高純度的質(zhì)粒DNA，在新管中進(jìn)行第二次超速離心，管頂加有含0.1mg/ml溴化乙錠的CsCl/TE緩沖液。
6）按質(zhì)粒DNA/EB溶液的1.5～2倍體積裝 Dower AG50W-X8柱子，用數倍體積的TE/0.2 mol/L NaCl溶液清洗和平衡柱子。
7)用注射器將混合有溴化乙錠的質(zhì)粒DNA溶液直接加到樹(shù)脂的頂部，注意不要搖動(dòng)樹(shù)脂。立即收集流出液。
8）用2倍于上樣質(zhì)粒溶液體積的0.2 mol/L NaCl /TE溶液洗脫柱子兩次，用同一管子收集流出液。也可以用等體積TE飽和的正丁醇來(lái)除去溴化乙錠。充分渦旋振蕩混勾，然后除去有機相，重復幾次直至在紫外燈下看不見(jiàn)紅色，然后加入3倍體積TE緩沖液來(lái)稀釋氯化銫。
注意：在本方法中產(chǎn)生的含有溴化乙錠的有機廢物應該妥善處理。
9)加入 2倍體積100%乙醇于室溫或-20℃沉淀質(zhì)粒DNA，于4℃，以 10 000 g 離心10 min。沉淀 DNA時(shí)溫度不要低于-20℃，以免氯化銫沉淀下來(lái)。
10）沉淀用70%乙醇洗滌1遍，真空干燥,溶解于TE緩沖液，并于4℃保存。
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